Phân loại protease và subtilisin

Protease hay peptidase (EC.3.4.-.-) là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp (Hình 1.1). Trong hệ thống hệ thống danh pháp MEROPS (www.merops.ac.uk) phân loại protease, subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh SB của nhóm serine protease (EC.3.4.21.-) với điểm đặc trưng là sử dụng đơn phân serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Ngoài subtilisin, trong phân nhánh SB còn có các protease liên quan đến quá trình xử lý tiền hormone như KEX2 protease, furin, và PC2. Hiện nay, người ta đã xác định được 97 loại substilisin từ 1659 trình tự trong đó có 16 substilisin đã được xây dựng cấu trúc không gian (

http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/make_frame_file?id=S8, ngày 23/04/2007).

Những protease trong họ S8A này đều có một domain bảo thủ với 7 nếp gấp β được bao bọc bởi 9 vòng xoắn α. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ 3 amino acid truyền thống của serine proease theo thứ tự là Asp-His-Ser (Hình 1.2. Bộ 3 xúc tác Asp-His-Ser đặc trưng của serine protease).

Cơ chế xúc tác của subtilisin

Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994):

        Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử cácbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amine (phản ứng khử) (Fastrez and Fersht, 1973).

        Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Hình 1.2).

Một số loại subtilisin

Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm (serine protease) với 2 đại diện được nghiên cứu nhiều nhất là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN''.

·        Subtilisin Carlsberg. Enzyme này được tìm thấy khi nuôi cấy B. licheniformis vào năm 1947 bởi Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg (Phadarate et al., 1997). Nó được thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa.

Hoạt tính của enzyme Carlsberg bị kìm hãm bởi các chất phản ứng, 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI), L-3-carboxytrans 2,3-epoxypropyl-leucylamido (4-guanidine) butane (E.64), di-isopropylfluorophosphate (DFP), phenylmethyl-sulfonyl fluoride (PMSF) và tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK). Một số khác lại bị kìm hãm bởi thuốc thử thiol ví dụ như p-chloromercuribenzoate (PCMB), đặc trưng đối với tất cả các serine protease (Govind et al., 1981). Subtilisin Carlsberg có tính đặc hiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết peptide cũng như các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ các amino acid thơm. Dưới tác dụng của enzyme này, một số triglyceride cũng có thể bị thủy phân như tripropionin và tributyrin. Subtilisin Carlsberg thủy phân từ 30 đến 40% liên kết peptide của casein. Giống như các serine protease khác, Ca2+ không ảnh hưởng đến độ bền của enzyme này, có pH tối ưu là 8,0-9,0 và bền trong phạm vi pH rộng từ 5,0 đến 11,0 (Zuidweg et al., 1972).

·     Subtilisin BPN''. Enzyme này đã được làm sạch và thu được ở trạng thái kết tinh từ chế phẩm công nghiệp BPN'' (bacterial protease Nagase). Từ chế phẩm BP Novo (bacterial protease Novo) đã tách được enzyme có thành phần amino acid tương tự subtilisin Novo (Forgarty, 1983). Subtilisin BPN'' được tổng hợp từ các loài B. amyloliquefaciens, B. subtilis và B. stearothermophilus (Zuidweg et al., 1972). Subtilisin BPN'' và subtilisin Carlberg khác nhau 58 amino acid nhưng C và pH 10 (Smith et al.,°chúng hoạt động tối ưu ở cùng một điều kiện là 60 1968; Phadarate et al., 1997; Siezen and Leunissen, 1997). Khác với subtilisin Carlberg độ bền của subtilisin BPN'' lại phụ thuộc vào Ca2+. Subtilisin BPN'' còn là một enzyme ngoại bào nên có thể dễ dàng thu hồi và tinh sạch hơn các enzyme nội bào, do vậy việc ứng dụng enzyme này ngày một phổ biến.

Subtilisin BPN'' là một serine protease ngoại bào và là một lớp enzyme đại diện lớn nhất của serine protease có cấu trúc đặc trưng là α/β/α và trung tâm hoạt động gồm Ser221, His64, Asp32 (Hình 1.3). Cấu trúc không gian ba chiều của chúng bền vững trong khoảng pH rộng và ngay cả khi có mặt của dung môi hữu cơ (Siezen and Leunissen, 1997; Thomas et al., 1999).

Subtilisin BPN'' là một pre-pro-enzyme (Wells et al., 1983). Trình tự pre- là một chuỗi gồm 30 amino acid có chức năng như một chuỗi peptide tín hiệu trong quá trình tiết subtilisin ra môi trường bên ngoài. Trình tự pro- gồm 77 amino acid được nối với subtilisin chỉ đến khi quá trình gấp nếp kết thúc và sau đó chúng tự động cắt bỏ khỏi phân tử subtilisin trưởng thành. Chính vì thế chuỗi peptide gồm 77 amino acid này được ví như một ‘foldase’ xúc tác cho quá trình gấp nếp của phân tử enzyme. Phân tử subtilisin trưởng thành gồm 275 amino acid và có khối lượng phân tử là 27,5 kDa (Ikemura and Inouye, 1988; Ohta and Inouye, 1990). Một số subtilisin khác. Ngoài hai nhóm subtilisin lớn kể trên còn có một số loại khác như: subtilisin E, subtilisin NAT, Tk-subtilisin (từ T. kodakaraensis KOD1). Sutilisin E và NAT đều được tổng hợp từ B. subtilis và trình tự gene mã hóa cho chúng cũng đã được xác định (Stahl and Ferrari, 1984; Nakamura et al., 1992). Việc phân tích trình tự nucleotid cho thấy sutilisin NAT có độ tương đồng 99,5% với subtilisin E, 86% với subtilisin BPN'' và 72% với subtilisin Carlsberg (Tetsumei et al., 2001). Tk-subtilisin được tổng hợp từ T. kodakaraensis KOD1.

Ứng dụng của subtilisin

Với sự đa dạng về chủng loại, subtilisin đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp với những tính năng phù hợp. Rất nhiều sản phẩm thương mại của subtilisin được đưa ra thị trường, chúng chủ yếu được sử dụng trong ngành công nghiệp các chất tẩy rửa, thuộc da và cả trong y dược học do subtilisin có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng và nhiệt độ cao.

Bảng 1.1 Một số thương phẩm subtilisin trên thị trường (Rao et al., 1998; Gupta et al., 2002). Lĩnh vực ứng dụng Tên thương phẩm/Hãng Nguồn gốc Bột giặt và chất tẩy rửa BIOTEX (Alcalasease) (Novo Industry A/S) B. licheniformis Bioprase (Nagase Biochemicals, Japan) B. subtilis Esperase, Savinase T (Novo Industry) Bacillus spp.

Sữa tắm Kem tắm làm trắng da NA (Công ty TNHH Sản xuất và Thương Mại Nhân Lộc) B. subtilis Công nghiệp thuộc da Aquaderm, NUE, Pyrase (Novo Nordisk) Công nghiệp thực phẩm GRAS B. subtilis và Endothia parasitica HT-proteolytic (Solvay Enzymes, GerSuby) B. subtilis Công nghiệp dược phẩm Luizym, Nortase Aspergillus oryzae Bioprase concentrate (Nagase Biochemicals, Japan) B. subtilis Đang nghiên cứu Cryst, alkaline protease (Nagase Biochemical, Japan) B. subtilis
 

Chất tẩy rửa

Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra. Một tiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩy rửa là hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần của chất tẩy rửa. Và tham số đóng vai trò chìa khóa cho việc bổ sung protease nào vào chất tẩy rửa là pI của chúng. Một protease phù hợp khi pI của nó trùng với pH của dung dịch chất tẩy rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu cầu khắt khe trên.

Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ B. licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus (Rao et al., 1998; Thangam and S., 2002), và chủ yếu là từ B. subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease (Gupta et al., 2002).

Công nghiệp thuộc da

Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996; Varela et al., 1997; Thangam and S., 2002).
 

Ứng dụng khác

Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc tính bền vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc (Fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al., 1993), làm nước mắm cá (Rebeca et al., 1991), làm thức ăn gia súc (Cheng et al., 1995), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang et al., 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994).

Nghiên cứu subtilisin của Bacillus B. subtilis

Theo mô tả trong khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. B. subtilis là trực khuẩn Gram dương có kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm. Ở điều kiện 100oC, bào tử của B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ (Kerovuo et al., 2000).

Năm 1971 đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở Bacillus. Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản và tính chất lý hóa của protease kiềm từ Bacillus (Horikoshi, 1971; Markland and Smith, 1971). Sang năm 1972, người ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn các protease kiềm ở một vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trường thương mại. Các vi khuẩn Bacillus ưa kiềm trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo “quan điểm công nghiệp (Horikoshi and Akiba, 1982; Horikoshi, 1996).

Gần đây, người ta đã thành công trong nhân dòng phân tử, giải trình tự nucleotide và biểu hiện gene mã hóa protease kiềm từ nhiều loài Bacillus (Desmond et al., 1975; Harry and Hausinger, 1989; Gupta et al., 2002). Các vector biểu hiện thường dùng để biểu hiện gene mã hóa subtilisin là: pET22b(+), pBS42, pUB110, pHY300PLK, pS1, pUC118, pUC119...

Cũng như các gene khác, gene mã hóa subtilisin có thể biểu hiện ở nhiều chủng chủ khác nhau. Các chủng chủ được sử dụng để biểu hiện gene mã hóa subtilisin:

· Escherichia coli các chủng: BL21, C600, HB 101, JM 109

· Bacillus các chủng: subtilis I-168, DB110, stearothermophilus

· Nấm: Saccharomyces serevisiae, Aspergillus oryzae, Streptococcus cremoris, Streptomyces lividans

Trong đó các chủng B. subtilis được sử dụng nhiều nhất vì đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền với toàn bộ genome đã được xác định. So với E. coli, B. subtilis có ưu điểm là vi khuẩn Gram dương không gây bệnh và không chứa độc tố. Tuy nhiên theo thám tử chúng có nhược điểm là plasmid tái tổ hợp chứa DNA ngoại lai thiếu bền vững nên việc biểu hiện trên B. subtilis thường yêu cầu tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể. Do đó, để khảo sát đặc tính một enzyme mới người ta thường lựa chọn biểu hiện trên E. coli trước. Sau đó, khi sản xuất protein lượng lớn thì chuyển sang hệ thống biểu hiện của B. subtilis.